章鱼彩票

POCKIT

  • POCKIT的检测原理为何?
    POCKIT的检测原理为聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction, PCR),利用具有专一性的引子(primer)针对特定的核酸序列进行扩增反应。目前PCR技术已经广泛的运用在人类疾病的检测、亲子鉴定、法医鉴定、遗传学研究等各种需要核酸侦测的领域。同时此一发明也获颁1993年诺贝尔化学奖,大幅的增加疾病检测的灵敏度,为近代分子生物学领域的最重大成就之一。
  • 为何POCKIT的设备操作可以比较传统的PCR简单?反应时间可以比较短?
    一般而言PCR在反应过程需要三种不同的温度,分别是利用高温解离DNA双股结构(92 – 95℃, denaturing),利用降低温度使专一性引子黏合于特定序列(37 – 65℃, annealing),以及再升温至最适于热稳定性DNA聚合酶活性的温度(72℃)进行延长反应(extension)。因此相关的操作设备必须能够快速的升温与降温,同时具备有高阶的温控系统。这使得设备变得相当复杂,重复的升降温也造成设备容易损坏,和反应时间的增加。

    POCKIT则是利用热对流的原理,此一物理现象即是描述当针对装有液体的容器底部加热时,由于上方表面较冷的液体比重较高,因此会因为重力向下移动;下方受热的液体则因为比重较低,因此会被挤到向上移动,因此会自然形成液体的循环。当较热的液体流动至表面时,又会因为环境的散热而变冷,较冷的液体流动至底部时又会因为受热而变热,所以此一循环可以一直持续下去,进而形成稳定的温度梯度。此时如果藉由容器的设计,利用最适的管径与高度,巧妙的控制对流的时间与散热的速率,就可以形成适合PCR的反应环境。当我们在特殊设计的容器中放入PCR反应的试剂,并且控制底部的加热温度在92 -95℃之间,当试剂流至底部时,就可以进行解离DNA双股结构的反应(denaturing),当液体循环至容器顶端并且降温时,就可以进行引子黏合(annealing),之后再循环至较热区域进行延长反应(extension)。换言之,当热对流不间断的过程之中,PCR的反应也随之完成。

    因此,POCKIT的优势就变的显而易见。首先,因为只需单纯的底部单一温度控制,因此不需复杂的控温系统与降温系统,可以大幅的轻量化,并且更加耐用。第二,自然的温度梯度取代机械式的升降温,使得反应更加稳定,避免机械故障,同时省去升降温所需的时间。POCKIT系统将热对流的速率控制在每一圈15 – 20秒左右,远比传统的PCR有效率,因此可以大幅缩减反应所需要的时间。
  • POCKIT的试剂与一般的PCR试剂有何不同?
    POCKIT的试剂与传统的PCR非常相似,包含有引子、dNTP、反应缓冲液、热稳定性DNA聚合酶、与核酸模板(template)等。因为POCKIT是利用荧光信号侦测PCR反应产物,因此尚需如real-time PCR一般加入荧光探针(probe),这也同时提高了反应的专一性。

    为了稳定热对流的流速,降低液体与管壁间的作用力,促进温度梯度的形成,以及提升DNA聚合酶的效率,POCKIT的反应缓冲液 – Uni-ii buffer中添加有若干的特定化学物。为了适用于更为宽广的引子条件,我们提供了高盐与低盐两种反应缓冲液,以供使用者选择。这也是POCKIT试剂与一般PCR最大的不同之处。
  • POCKIT的引子在设计上与一般的PCR试剂有何不同?
    与real-time PCR类似,并应依照下列的基本规则设计:
    ● 产物大小应小于150盐基对(bps),一般而言愈小愈好。
    ● Tm应在58 – 62℃之间
    ● 避免4个以上的连续相同盐基
    ● 3'末端的5个盐基避免含3含以上的G与C
    ● G与C的比例应该占全部的20 – 80%之间
    ● 总长度应在15 – 25个盐基之间
  • POCKIT的荧光探针在设计上与一般的real-time PCR试剂有何不同?
    最适用于POCKIT的荧光探针为TaqMan probe,其基本的设计规则如下:
    ● 5'端荧光团应使用FAM (520 nm)或 JOE、VIC (550nm)
    ● 3'端荧光抑制染剂(quencher dye)应用black hole quencher (BHQ1)或是minor groove binder (MGB)
    ● Tm应在68 – 72℃之间 – 高于引子10℃
    ● 与引子间应至少有一个mer 的距离以避免立体干扰
    ● 避免4个以上的连续相同盐基

    以下为与一般real-time PCR不同之处
    ● G与C的比例应该占全部的40 – 80%之间
    ● 总长度应在15 – 30个盐基之间,短比长好
    ● 5'端与模板间的黏合强度要强(较大的负自由能,ΔG)
    ● 应避免设计在模板二级结构的稳定区域
  • 是否一定要使用POCKIT专用的毛细管进行反应?
    是的。因为以下的原因:
    ● 光学塑料材质:荧光透光性强
    ● 医疗塑料等级:无DNase/RNase污染
    ● 专利底部金属环设计:加热均匀
    ● 完美管径与管高比例:提供热隔绝恒温PCR的最佳环境
    ● 内径平整:稳定热对流循环
    ● 紧配内盖:避免试剂挥发污染
  • 是否有已经商品化的试剂可以直接使用,而不需自行设计?
    有的,可以运用于POCKIT系统并且已经商品化的试剂如下:
    ● IQ plus系列:为针对水产养殖市场所开发的试剂组劑組
    ● PetNAD系列:为针对宠物市场所开发的试剂组
    ● POCKIT kits for food animal系列:为针对家畜禽养殖市场所开发的试剂组
    详细的内容请参考公司网站或是各品牌的网站
  • 已经商品化的POCKIT试剂是否也可以用在传统的PCR或是real-time PCR之上?
    可以,但是因为以下的原因并不建议
    ● 反应条件未于传统PCR或是real-time PCR上最优化
    ● 引子与酵素的浓度高于传统PCR或是real-time PCR所需,较易产生非专一性反应
    ● 不含被动性荧光染剂(passive dye, 如ROX)
    ● 缓冲液系统与传统PCR或是real-time PCR不同
  • POCKIT可以侦测RNA吗?可以执行反转录反应(reverse transcription)吗?
    可以,POCKIT内建程序中最开始就是执行50℃10分钟的反转录反应。不论是DNA或是RNA的模板,系统都会一律的执行此一步骤。POCKIT系统所提供的Uni-ii缓冲液同时适用于反转录反应以及PCR反应,使用者只需确认于反应中有添加反转录酵素(MMLV or AMV reverse transcriptase)即可。添加量与传统的PCR相同。
  • POCKIT在检测运用上有那些限制?
    POCKIT是针对于核酸,也就是DNA以及RNA进行检测,因此对于感染性疾病的病源,如病毒、细菌、寄生虫等的核酸,或是某些因为特定DNA变异造成的遗传性疾病,都可以有效的检测。但是对于一些代谢的指标,如肝指数、血糖等,或是不具核酸的病源如狂牛症,以及像是毒品与禁药、农业等化学物质,则无法进行检测。
  • POCKIT是新的技术吗?它的质量稳定吗?
    POCKIT是全新的技术,但是基于以下的原因,它也是非常稳定的技术
    ● POCKIT的基本原理是PCR,是分子生物领域最广为应用,最稳定的技术
    ● POCKIT的加热原理与反应采用自然界的现象 - 热对流,比机械式的控制更为简单、有效

    ● POCKIT的研发、生产、与销售流程皆符合医疗器材质量管理系统ISO13485:2003以及体外检测(in-vitro diagnosis, IVD)

    GMP的生产规范。

    ● POCKIT的生产制造商 - 瑞基公司,是台湾分子检测市场的标竿企业。其2011年所获奖项如下:
      小巨人奖
      台北生技奖金牌奖
      行政院农委会菁创奖
      中部科学园区创新产品奖
      亚洲科学园区协会优良生技厂商奖
    ● 运用POCKIT技术于不同领域的学术研究已经陆续发表在全球知名期刊之上,证明这是一种有效且可以广泛运用的技术。
    ● 运用POCKIT技术所开发的试剂 - IQ plus WSSV Detection System已通过
  • POCKIT是可携带式的设计吗?在操作环境上有没有限制?
    POCKIT在设计之初就是锁定现场携带式的核酸检测设备,因此当有这种需求时,可以选择投资POCKIT Xpress – 行动实验室。它包含了POCKIT核酸分析仪一台,cubee小型高速离心机一台,以及高精度移液器二支,上述设备都包装于仪器专用防水硬壳行李箱之中。行李箱内还具有专门的空间可以放置塑料类的耗材,与反应所需的试剂,足以应付现场从采集样本、核酸萃取、一直到最终PCR结果分析的所有需求。

    POCKIT在操作环境上仍然是有基本的限制存在,包括:
    ● 必须有稳定的交流电源供应,100 – 240V,50/60Hz
    ● 摆放仪器的平面必须相对平整
    ● 环境温度的范围为15 - 35℃
    以上二、三点皆与热对流的稳定性有关。
  • POCKIT可以于单一反应检测多重标的吗?
    可以,POCKIT的光学系统可以利用窄波长滤镜(band pass filter),收取520nm及550nm两种不同的散射光源信号,因此只要将不同标的的荧光探针分别标定合适的荧光物,如FAM (520nm)以及JOE (550nm),即可于单一反应之中同时检测两种标的。

    POCKIT系統的PCR反應是利用熱對流所產生的溫度梯度所驅動,與傳統的PCR不同,因此在設計雙重標的(duplex system)的實驗時,必須要特別注意引子、探針之間產生雙重子(dimer),以及引子、探針本身產生二級結構的可能,以避免反應之間互相干擾。

    双重标的系统之间多少都会彼此竞争反应资源,此一部份的设计理念与传统的双重标的PCR系统相同。
    因为荧光物质的特性,520nm的散射光信号可能会影响到550nm,因此一般建议请将主要的检测标的设计于520nm,并将次要的标的如内控制组(internal control)设计于550nm。
  • 使用者可以自行设定反应条件吗?
    使用者唯一可以设定的反应条件是波长的选择,分别是520nm单波长、550nm单波长、以及520 + 550nm双波长三种选择。 在反转录以及热隔绝恒温PCR部分,经过多年的研究与测试,最广泛性且优化的反应条件组合已经被找到,并且已经成功的运用在POCKIT系统之上。为了轻量化、使用接口简单化和人性化、和可移植性设计,POCKIT将所有非必要的功能都尽量舍弃,因此使用者无法自行设定相关的反应条件。然而,单一反应条件、人性化使用接口、与极简的设计理念,正是POCKIT与众不同之处。
  • 使用者于反应结束后需要自行判读结果吗?
    POCKIT内建Android智能型手机芯片系统,会于反应前后搜集、运算、监控内部光学系统的运作,并于反应结束后直接将荧光信号的变化比转化为结果,并且显示于触控屏幕上。因此使用者无需自行判读结果,所有的工作POCKIT都会代为执行。同时反应前后光学系统的定位照片、荧光原始读值、荧光比、与判读结果,都会存档于SD卡中以开机时间为目录名的目录之下,可供用户随时做为查询、记录、确认之使用。
  • POCKIT是定量的系统吗?可以像real-time PCR一样定量吗?
    POCKIT的光学系统设计与试剂设计原理都与real-time PCR非常相似,有潜力可以发展成定量的系统,但是为了考虑具有定量需求的现场检测项目有限,同时为了贯彻轻量化、使用接口简单化和人性化、和可移植性设计,POCKIT舍弃了定量功能,而只具备了判读正负的定性能力。 当科技持续进步,使得芯片运算与控制能力进一步提升时,下一代的POCKIT将会很有机会可以像real-time PCR一样,具有核酸定量能力,同时保有可携式的特性。
  • 请问要如何优化自行设计的POCKIT引子对?判定的标准为何?
    PCR反应的成败有相当程度的依赖引子的质量,其可能的影响因子如下:
    ● 引子的设计:Tm、二级结构、双重子(dimer)的形成可能等
    ● 引子的合成质量:供货商的经验、合成原物料的质量、纯化的方法等
    ● 引子的浓度

    使用者基本上可以依照Q4所述的原则进行设计,并建议如下:

    ● 左右两端的引子除了原本的设计之外,都可以试着以多一两个盐基或是少一两个盐基的方式多合成几条,并藉由不同的

    排列组合中,找到最佳的引子对

    ● 合成时要求引子必须以PAGE纯化
    ● 合成时要求引子必须以PAGE纯化
    ● 测试不同的引子对比例,以及浓度,以及使用的酵素浓度,找寻最佳条件。
    ● 在灵敏度上,可藉由阳性样品的序列稀释,测试不同条件的稀释终点,以最灵敏的条件为最佳
    ● 在灵敏度上,可藉由阳性样品的序列稀释,测试不同条件的稀释终点,以最灵敏的条件为最佳
    ● 一般而言,POCKIT系统的灵敏度至少可达100 copies/反应
  • 我没有接触过荧光探针,请问我可以从哪里获得设计荧光探针的知识?
    可以上网找寻有关TaqMan probe的相关信息,或是与瑞基公司的技术团队联络。其基本的设计原理已于Q5的回答中详述。
  • 瑞基公司有提供荧光探针的合成与测试服务吗?
    并没有,但是我们提供POCKIT系统荧光探针的设计咨询服务,以及改善方向的建议。
  • 请问市售的PCR缓冲液与酵素可以直接用在POCKIT这套系统上吗?
    可以,但是并不建议。如Q3的回答中所描述,为了稳定热对流的流速,降低液体与管壁间的作用力,促进温度梯度的形成,以及提升DNA聚合酶的效率,POCKIT的反应缓冲液 – Uni-ii buffer中添加有若干的特定化学物,而这些物质是市售PCR缓冲液中所没有的。因此,仍然建议使用POCKIT的专属缓冲液。POCKIT专用的Uni-ii buffer中已含有最佳浓度的dNTP,因此使用者不需另行添加。

    至于酵素部份,因为市售的品牌与种类繁多,使用者必须自行测试与比较,如果不想浪费时间在测试酵素上,也可以直接选购POCKIT专用的酵素。酵素的使用量会依不同的反应系统而不同,于条件优化之前,可先依传统PCR及RT-PCR的建议使用量添加,之后再依优化的结果酌予增减。

Q&A问题